結(jié)構(gòu)生物學(xué)對(duì)于生物技術(shù)、藥物發(fā)現(xiàn)等許多領(lǐng)域都大有裨益，是當(dāng)今生物學(xué)界的研究熱點(diǎn)。在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域，最富傳統(tǒng)意義的結(jié)構(gòu)解析方式是X射線晶體學(xué)（X-ray crystallography），其研究對(duì)象是內(nèi)部質(zhì)點(diǎn)具有規(guī)則排列性質(zhì)的晶體。但此方法必須以具有高質(zhì)量的大尺寸晶體作為前提。然而得到質(zhì)量較好的晶體對(duì)于分子量巨大或者結(jié)構(gòu)柔性的對(duì)象來(lái)說(shuō)往往較為困難，尤其是針對(duì)膜蛋白這一目前科研人員很感興趣的對(duì)象，其結(jié)晶難度更大。為了解決這一問(wèn)題，基于冷凍電子顯微鏡的衍生出了兩種重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)手段——單顆粒分析技術(shù)（single particle analysis，SPA）和微晶電子衍射技術(shù)(Micro electron diffraction，MicroED)，本文將對(duì)這兩種技術(shù)的原理和技術(shù)特點(diǎn)進(jìn)行介紹和對(duì)比分析。

在過(guò)去十幾年間，SPA和MicroED冷凍電鏡技術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，正在迅速地超越X射線晶體學(xué)，成為研究大分子結(jié)構(gòu)的首選方法。2017年，Jacques Dubochet、Joachim Frank和Richard Henderson因冷凍電鏡單顆粒法方面的工作而被授予諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；

2018年，MicroED被國(guó)際權(quán)威Science雜志評(píng)選為年度全球十大科技進(jìn)展之一，共同入選的還有應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)的基因沉默藥物、單細(xì)胞測(cè)序追蹤單細(xì)胞發(fā)育譜系等十項(xiàng)生命科學(xué)、物理、化學(xué)等領(lǐng)域中的全球頂尖成果。

冷凍電鏡SPA介紹

SPA原理和發(fā)展歷史：

單顆粒分析技術(shù)利用的是電子顯微鏡的成像性質(zhì)。通過(guò)將生物大分子的溶液樣品快速投入至冷卻到液氮溫度的液態(tài)乙烷中，得到冰層厚度合適的冷凍樣品，然后對(duì)冰層中均勻分布的生物大分子顆粒進(jìn)行拍照。通過(guò)算法對(duì)拍到的上千張不同角度的二維照片進(jìn)行分析，最終得到蛋白結(jié)構(gòu)，此方法稱之為單顆粒分析技術(shù)（single particle analysis）。因此單顆粒分析技術(shù)是對(duì)冰層中的樣品顆粒進(jìn)行成像，不需要X射線晶體學(xué)所需的晶體。其測(cè)試過(guò)程示意圖如下，正式進(jìn)行樣品觀察和數(shù)據(jù)收集之前，樣品還需進(jìn)行負(fù)染篩選，從而得到均一性高的樣品，負(fù)染篩選過(guò)程一般在200KV的透射電鏡上進(jìn)行，正式的數(shù)據(jù)收集需要在300KV的透射電鏡上進(jìn)行。得到二維照片之后還需要經(jīng)歷圖像的預(yù)處理，目標(biāo)樣品顆粒的提取和篩選以及蛋白的三維重構(gòu)，最終得到蛋白的3D模型。

目前，單顆粒分析技術(shù)的分辨率已經(jīng)達(dá)到了近原子水平（約3Å水平），用該方法解析出的生物大分子三維結(jié)構(gòu)所占的比例越來(lái)越大，而且眾多過(guò)去無(wú)法解析的無(wú)對(duì)稱重要生物大分子結(jié)構(gòu)也被解析出來(lái)。歸納起來(lái)，單顆粒法的發(fā)展得益于以下技術(shù)的發(fā)展：

• 快速冷凍固定技術(shù)——這種方式的冷卻速度極快，使得水分子還來(lái)不及轉(zhuǎn)向就被固定在原處，得到的冰層不是晶態(tài)，而是無(wú)定形態(tài)，在電子相當(dāng)于透明。

• 高‍性能透射電鏡的推陳出新——高加速電壓300KV、球差矯正器、能量過(guò)濾器、相位板、高穩(wěn)定性樣品臺(tái)等等；

• 直接電子探測(cè)相機(jī)——傳統(tǒng)的CMOS相機(jī)需要經(jīng)歷電-光-電的轉(zhuǎn)換，能量利用率低，為了保證一定的圖像襯度，入射電子束的劑量就需要很高。然而生物樣品最怕的就是高劑量電子束。直接電子探測(cè)器直接跳過(guò)了電-光-電轉(zhuǎn)換過(guò)程，只需要很低劑量的電子束流就足以產(chǎn)生高襯度的照片。

• 漂移矯正技術(shù)——在電子束照射下冷凍樣品會(huì)有一個(gè)明顯的漂移，使用直接電子探測(cè)器，可以記錄在非常短的時(shí)間內(nèi)拍攝到的信號(hào)，然后對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的照片上樣品的移動(dòng)進(jìn)行校正。SPA優(yōu)勢(shì)Advantages

• 相對(duì)于X射線衍射，單顆粒法最大的優(yōu)勢(shì)是省去耗時(shí)費(fèi)力的蛋白結(jié)晶過(guò)程，因此越來(lái)越受到結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究者的青睞。

• 此外，樣品的快速冷凍處理技術(shù)可以使得樣品在接近自然生理的環(huán)境下進(jìn)行測(cè)試；

• 樣品消耗量極少，僅需0.1mg即可，為研究人員節(jié)省寶貴的蛋白樣品；

SPA不足Disadvantages

• 雖然SPA無(wú)需結(jié)晶，但最大的問(wèn)題是分辨率很難達(dá)到X射線技術(shù)的水平，一般來(lái)說(shuō)只能到3Å水平。因此一些配體，比如小分子藥物跟靶標(biāo)蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)中，不一定能夠在電鏡的密度圖中觀測(cè)到；

• 小分子量的蛋白質(zhì)顆粒由于襯度不足，無(wú)法得到高分辨圖像，因此SPA要求蛋白質(zhì)樣品的分子量需要大于200KDa，小分子量的樣品需要通過(guò)復(fù)合其它蛋白做成大分子量的樣品再進(jìn)行測(cè)試；

• 測(cè)試通量低，SPA樣品需要連續(xù)幾天進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，一般來(lái)說(shuō)，每臺(tái)設(shè)備一周只能測(cè)試1-2個(gè)樣品；

• SPA對(duì)硬件的要求極高，設(shè)備昂貴且維護(hù)成本高，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作經(jīng)驗(yàn)也要求很高，不同的實(shí)驗(yàn)者，成功率可能差別很大。因此，SPA的測(cè)試費(fèi)用讓很多研究人員望而卻步。

SPA案例

單顆粒分析技術(shù)不需要得到晶體且樣品使用量非常少，這使得針對(duì)難以結(jié)晶的蛋白或大分子復(fù)合物的研究成為可能。如膜蛋白、抗體-抗原表位鑒定、AAV衣殼等等。

2020年3月發(fā)表在Science雜志的研究通過(guò)冷凍電子顯微鏡單顆粒分析技術(shù)，確定了與胰高血糖素及不同類(lèi)別的異源三聚體G蛋白（Gs或Gi1）結(jié)合的人源胰高血糖素受體（GCGR）3.7 Å和3.9 Å的結(jié)構(gòu)。該研究的多個(gè)結(jié)構(gòu)與藥理學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合，為II型糖尿病和肥胖癥的治療提供了重要見(jiàn)解1。

抗原表位即抗原決定簇，是由連續(xù)或者不連續(xù)氨基酸組成的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，其特殊三維結(jié)構(gòu)所包含的線性表位和構(gòu)象表位以及化學(xué)特性決定了抗原決定簇的抗原特性。Li等人通過(guò)冷凍電鏡SPA解析得到了HPeV3 (EMD-0069)病毒表面抗原決定簇和與抗體結(jié)合后復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)2，結(jié)構(gòu)示意圖如下所示。

MicroED介紹

MicroED原理

根據(jù)衍射的原理，只要具有波的性質(zhì)，就能對(duì)晶體產(chǎn)生衍射。電子波同 X 射線一樣，照射到類(lèi)似晶體的樣品上時(shí)也能夠發(fā)生衍射現(xiàn)象。所以以電子波為光源的電子顯微鏡除了成像模式外，還有衍射模式。當(dāng)中間鏡的物平面位于物鏡的后焦面時(shí)，將在熒光屏上得到經(jīng)中間鏡和投影鏡放大了的電子衍射譜，即為透射電子顯微鏡的衍射模式。通過(guò)電子對(duì)微小的晶體進(jìn)行衍射，收集電子衍射數(shù)據(jù)并進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的方法被稱為MicroED。其測(cè)試過(guò)程示意圖如下：

MicroED特點(diǎn)

1. 分辨率高，由于電子的波長(zhǎng)比X射線的波長(zhǎng)更短，則受物質(zhì)散射強(qiáng)（原子對(duì)電子的散射能比 X 射線強(qiáng)一萬(wàn)倍），所以在理論上能夠達(dá)到更高的分辨率。

2. 納米晶體、蛋白質(zhì)晶體培養(yǎng)難度大大降低。電子衍射在許多方面類(lèi)似于X射線衍射，同樣依賴于有序的晶體，但MicroED所需的晶體樣品只要求百納米3，比傳統(tǒng) X 射線晶體學(xué)所需的晶體體積小數(shù)十億倍4。一方面是因?yàn)榕cX射線相比，電子與原子相互作用的散射截面要大得多5，電子與物質(zhì)的相互作用也強(qiáng)得多（原子對(duì)電子的散射比 X 射線強(qiáng)一萬(wàn)倍）， 另一方面是因?yàn)榉菑椥陨⑸溽尫诺綐悠飞系哪芰扛��?， 所以微米尺寸的晶體就可以產(chǎn)生足夠高的信噪比衍射信號(hào)。

3. 樣品不能過(guò)厚。當(dāng)晶體大于3 μm時(shí)，電子束將無(wú)法穿透樣品，不會(huì)產(chǎn)生衍射信息�？紤]到電子的平均自由程，晶體的厚度直接決定了衍射數(shù)據(jù)的質(zhì)量6。對(duì)于300 kV加速電壓得到的電子，其冷凍生物樣品的平均自由程約為350 nm，而對(duì)于200 kV加速電壓得到的電子，其平均自由程約為 300 nm7。過(guò)厚的晶體會(huì)更頻繁的吸收電子，產(chǎn)生更多的多次彈性散射。4. 浸泡成功率高。靶標(biāo)蛋白-小分子藥物配體的共晶結(jié)構(gòu)是藥物設(shè)計(jì)過(guò)程中最關(guān)鍵的信息，共晶復(fù)合物往往通過(guò)浸泡的方法獲得。小分子更容易進(jìn)入納米級(jí)別尺寸的晶體，且更不易產(chǎn)生晶體破裂等情況，大幅提高浸泡成功率。5. MicroED對(duì)設(shè)備的要求較低，相對(duì)低端的透射電鏡也能實(shí)現(xiàn)高分辨率的電子衍射數(shù)據(jù)采集，幾分鐘即可完成一套數(shù)據(jù)的收集，即使需要多套數(shù)據(jù)合并，也能在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，實(shí)現(xiàn)快速和高通量測(cè)試。

MicroED案例分享

在MicroED發(fā)展初期，溶菌酶、catalase和 Ca2+-ATPase等模式樣品就被解析到原子分辨率。隨著MicroED的進(jìn)一步發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)不再局限于解析模式樣品，來(lái)自于瑞典的斯德哥爾摩團(tuán)隊(duì)還解析了α-synuclein中心肽段和R2lox酶8等未知蛋白的結(jié)構(gòu)（見(jiàn)下圖），并且分辨率都高達(dá)~1 Å。

MicroED解析的R2lox結(jié)構(gòu)圖

2016年后，MicroED發(fā)展迅速，解析的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的數(shù)量也隨之快速增加，prions和 FUS LC（fused in sarcoma low-complexity domain）等樣品的晶體結(jié)構(gòu)都得到了1 Å左右的高分辨率。而后MicroED解析對(duì)象的難度逐漸增加，甚至還包括了復(fù)合物和離子通道等膜蛋白，下圖便是MicroED技術(shù)解析的GPCR蛋白A2AR。

MicroED技術(shù)解析的膜蛋白A2AR結(jié)構(gòu)9

除了生物大分子之外，MicroED對(duì)化學(xué)小分子、天然產(chǎn)物、藥物制劑的研究更加合適。因?yàn)榛瘜W(xué)小分子呈現(xiàn)粉末狀，尺寸上與其的研究范圍非常契合，很多利用MicroED研究化學(xué)小分子的成功案例都驗(yàn)證了此技術(shù)的高效性和應(yīng)用性（見(jiàn)下圖）。

MicroED得到的化學(xué)小分子及天然產(chǎn)物的案例10