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CAR-NK細胞療法的研究進展與挑戰(zhàn)最近幾年，腫瘤免疫細胞療法發(fā)展迅速，尤其是CAR-T細胞，已經(jīng)有五款CAR-T細胞療法產(chǎn)品獲得美國FDA批準上市。國內(nèi)也迎來了第一款CAR-T細胞產(chǎn)品的上市。 NK細胞的安全性及其抗腫瘤潛力，使它們成為實施CAR技術(shù)的有希望的細胞類型，可將其細胞毒性潛力重定向至特定靶標。目前，CAR-NK細胞的免疫療法研究成為越來越多研究者的選擇方向。
NK細胞來源非常廣泛，比如外周血、臍帶血、胚胎干細胞、人類誘導多能干細胞和NK細胞系，不同來源的NK細胞有著各自的優(yōu)勢和缺陷。由于NK細胞可以經(jīng)歷的細胞分裂數(shù)量有限，很難擴增為輸注所需的大量細胞。因此，研究者們逐步使用NK細胞系（如NK-92、YTS、KHYG-1等）代替從臍帶或外周血獲得的原代NK細胞進行了研究。 CAR-NK細胞的研究進展 在血液系統(tǒng)腫瘤中，目前研究較多的為CD19-CAR-NK細胞和CD33-CAR-NK細胞。
1.急性白血病 CAR-T細胞治療急性淋巴細胞白血�。ˋLL）已顯示出顯著臨床療效，但該療法對急性髓系白血病（AML）療效不佳。從理論上講，CAR-NK細胞比CAR-T細胞具有更有利的毒性，特別是在避免CRS等副作用方面。然而，這方面的臨床數(shù)據(jù)尚無報道。 Xiaowen Tang等評估了CD33-CAR-NK細胞在復發(fā)和難治性AML患者中的安全性。該研究共入組3例患者，采用第二代CAR，結(jié)果顯示在5x109個細胞的輸注劑量下，沒有明顯的不良反應，并且與CAR-T細胞相比，CAR-NK-92細胞的成本生產(chǎn)更低，相信經(jīng)過優(yōu)化后將被廣泛用于治療腫瘤。 2.淋巴瘤 MD安德森腫瘤中心I/IIa期試驗的結(jié)果顯示，以CD19為靶點的臍帶血來源的CAR-NK細胞療法，在復發(fā)性/難治性非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者和慢性淋巴細胞白血病（CLL）患者中顯現(xiàn)出臨床療效，而且未觀察到嚴重毒性反應。 該研究共入組11例患者，其中5例CLL患者，6例NHL患者，所有患者均接受最少3線和最多11線的先前治療。8例患者（73%）獲得緩解，其中7例（4例淋巴瘤，3例CLL）完全緩解，1例Richter’s轉(zhuǎn)化成分緩解，但有持續(xù)性CLL。 在注射后30天內(nèi)，所有劑量水平的反應都很迅速，注入的CAR-NK細胞擴增并維持在低水平至少12個月。另外，研究結(jié)果表明，CAR-NK細胞的使用與CRS、神經(jīng)毒性或GVHD的發(fā)生無關(guān)，炎癥細胞因子（包括IL-6）的水平也沒有增加。 Fate Therapeutics公司近期公布異體iPSC衍生的CAR-NK細胞FT596的臨床數(shù)據(jù)，F(xiàn)T596單藥治療表現(xiàn)出持久的腫瘤清除能力和延長的體內(nèi)存活率，顯示出iPSC衍生的NK細胞療法成為新型癌癥免疫療法的開發(fā)前景。 此外，F(xiàn)T596在與利妥昔單抗聯(lián)用時，與單獨使用利妥昔單抗相比，F(xiàn)T596在體內(nèi)顯示出對CD20+淋巴瘤細胞殺傷的增強。這初步顯示出，抗體藥物與NK細胞治療聯(lián)合應用可以發(fā)揮協(xié)同效應，將會是CAR-NK細胞又一個開發(fā)新方向。 3.多發(fā)性骨髓瘤（MM） MM是在B淋巴細胞分化成漿細胞的過程中發(fā)生的遺傳突變導致的惡性腫瘤。MM細胞系中常見的腫瘤抗原有CS1、CD138、BCMA等。關(guān)于CAR-NK細胞產(chǎn)品治療MM的研究相對較少。目前用于治療MM的CAR-NK細胞產(chǎn)品多采用NK92細胞系，所采用的腫瘤抗原多為CS1和CD138。 細胞表面糖蛋白CD2子集1（CS1）是MM細胞表面高度表達的蛋白質(zhì)，多參與MM細胞黏附和生長。CD138參與MM細胞的黏附、生長和成熟，是MM主要的診斷標記。體外研究已經(jīng)證實，分別利用CS1和CD138為靶點設計的CS1-CAR-NK92細胞和CD138-IFNα-CAR-NK92細胞成功抑制MM細胞生長，延長了骨髓瘤小鼠的存活期。 CAR-NK用于治療實體瘤的研究 CAR-T細胞在抗擊實體腫瘤的過程中，會出現(xiàn)PD-1/PD-L1介導的免疫抑制。NK細胞表面PD-1表達很低，相對受腫瘤微環(huán)境免疫抑制小，也許是抗擊實體瘤的良好候選者。 在實體瘤研究中，CAR-NK細胞的研究靶點多是靶向表達HER2、PSMA、mesothelin、ROBO1或MUC1等腫瘤相關(guān)抗原的轉(zhuǎn)移性實體惡性腫瘤，例如前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和非小細胞肺癌。
目前，CAR-NK針對實體瘤的治療逐漸展開。 CAR-NK細胞的挑戰(zhàn) 盡管CAR-NK細胞吸引了很多研究者的目光，其也存在一定問題。CAR-NK細胞作為一種治療性癌癥的成功實施目前受到三個主要因素的阻礙，即，（1）NK細胞對基因工程的抗性；（2）NK細胞的增殖潛力有限；（3）它們對輸液的持久性有限。 NK細胞對基因工程的抗性挑戰(zhàn) 病毒轉(zhuǎn)導 從歷史上看，逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒對原代NK細胞的病毒轉(zhuǎn)導效率均較差�；讦媚孓D(zhuǎn)錄病毒的載體需要細胞積極增殖才能進入細胞。慢病毒的載體既可以感染循環(huán)細胞也可以感染非循環(huán)細胞，并攜帶較大的轉(zhuǎn)基因，但由于其生存能力往往受到負面影響，因此它們在原代NK細胞中的效率也受到限制。 電穿孔 基因工程NK細胞的一種非病毒策略是通過DNA或mRNA質(zhì)粒的電穿孔。DNA的電穿孔效率很低，且無法在DNA中穩(wěn)定整合構(gòu)建體。 轉(zhuǎn)座子 目前正在研究的非病毒轉(zhuǎn)導的一種替代方法是使用轉(zhuǎn)座子。最常用的兩種主要方法——piggyBac和睡美人(SB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，目前正在臨床測試基于SB的CAR載體。 SB最初來源于魚類，但在人類基因組中仍保留其活性。它由兩個部分組成：介導剪切和粘貼的SB轉(zhuǎn)座酶和側(cè)翼為末端反向重復序列(TIR)的DNA載體，轉(zhuǎn)座酶可以與之結(jié)合以介導其幾乎隨機整合到基因組中。 這種方法可以轉(zhuǎn)導長度大于100kb的基因，使其成為CAR整合的一個有吸引力的更高效率選擇。轉(zhuǎn)座子工程化的CAR-NK細胞是一種有前途的替代方法，可以在沒有病毒整合的情況下實現(xiàn)穩(wěn)定表達。 CRISPR/Cas9 先前討論的轉(zhuǎn)導方法依賴于載體整合，而沒有指定整合位點。必需存活基因或腫瘤抑制基因的整合和隨后破壞的可能性對于臨床產(chǎn)品可能是有害和危險的。與轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應核酸酶(TALEN)或鋅指核酸酶(ZFN)等類似方法相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)開啟了高效靶向基因整合的可能性。 解決NK細胞的增殖潛力有限的挑戰(zhàn) 1.基于細胞因子的擴增 基于細胞因子的擴增方案通常依賴于超生理水平來誘導原代NK細胞的擴增。 2、基于飼養(yǎng)層的擴增 基于飼養(yǎng)層的擴增方案將來自飼養(yǎng)層系統(tǒng)的受體介導的輸入與細胞因子支持相結(jié)合，以促進原代NK細胞的大規(guī)模擴增。 解決NK體內(nèi)擴增的挑戰(zhàn) 來自過繼細胞療法(ACT)臨床試驗的證據(jù)通常無法在輸注后1-2周內(nèi)檢測到輸注NK細胞的存在。雖然NK細胞的短壽命有助于它們在ACT環(huán)境中的安全性，但它也顯著縮小了治療窗口。 小結(jié) 目前，全球正在進行的臨床試驗進行的薈萃分析確定了520項有效試驗，共檢查了64種不同的CAR，其中96.4％的試驗使用CAR-T細胞。因此，就將實驗室研究轉(zhuǎn)化為臨床環(huán)境而言，CAR-NK細胞領(lǐng)域仍處于起步階段。
隨著CAR-NK細胞療法的臨床價值凸顯，不管是賽諾菲、百時美施貴寶等制藥巨頭還是Catamaran Bio、Artiva Bio等生物技術(shù)初創(chuàng)公司都相繼布局CAR-NK賽道。顯而易見，CAR-NK已成為繼CAR-T之后最引人關(guān)注的工程細胞療法。 近些年隨著對NK的細胞生物學，免疫學，以及記憶性NK細胞的研究和認識越來越深入以及對于NK細胞的免疫相關(guān)受體的信號通路等新的研究.。越來越多的研究為NK細胞在免疫治療中的應用奠定了良好的基礎(chǔ)，相信隨著理論知識的更加完善，臨床研究的進行，以及對當前CAR-NK細胞面臨挑戰(zhàn)的攻克，CAR-NK細胞療法也許會為腫瘤免疫治療帶來革命性進展，CAR-NK細胞的治療方法在今后也能占據(jù)一方舞臺。 參考資料： 1.https://mp.weixin.qq.com/s/a8PZZLfWYf684aH4BfkVUQ 2.https://mp.weixin.qq.com/s/nLKPgREeE3jLJ4O9XxQQEw |
